豚鼠(guinea pig)是草食性动物,性情温顺,胆小,对外界刺激极为敏感,喜居干燥、清洁的环境。自动调节体温能力较差,对环境变化极为敏感,最适宜的温度是18-20摄氏度,对抗生素敏感。目前国内实验动物用豚鼠多为短毛的英国种豚鼠。不同毛色的英国种豚鼠杂交可形成不同的变种,如纯白色、黑色、棕色等,因此这些非纯种短毛豚鼠,被毛颜色是多样的,但基本是棕黄、黑、白三种颜色,可以棕黄、黑、白相同,形成不规则的斑点,称三色豚鼠,也可有二色或单色豚鼠。
白化豚鼠其Ig 含量上显著低于普通花色豚鼠;非特异免疫里的补体含量和活性均显著低于花色豚鼠。白化豚鼠在长期的培育 ,过程中已经形成独特的免疫学特性,其总体免疫学功能弱于花色豚鼠。白化豚鼠的抗病能力弱于花色豚鼠,对各种病原更为敏感,更适合制作感染类疾病的动物模型;实验结果还提示:花色豚鼠血清补体含量及活性显著高于白化豚鼠,如果做补体采集应考虑选择花色豚鼠。
豚鼠在系统发育上与小鼠和大鼠相距甚远,因此,可以免疫豚鼠产生多克隆抗体。
图1 豚鼠
大多数脊椎动物的免疫系统产生,抗体是 Y 形球状蛋白,由 B 淋巴细胞分泌或呈现在 B 淋巴细胞表面。抗体(Ig)分子通常由两条相同的重链 (IGH) 和两条轻链(IGL或IGK)组成。在豚鼠中已经报道两个 IgG 亚类,它们在 C H结构域中氨基酸相似性有 73% 的。豚鼠IgM、IgG、IgE和IgA四类抗体恒定区氨基酸序列见图2,豚鼠通常产生少量的IgM。
图2 豚鼠免疫球蛋白重链恒定区氨基酸序列
老龄雌性豚鼠的血清中含有丰富的补体,是所有实验动物中补体含量最多的一种动物,其补体非常稳定,免疫学实验中所用的补体多来源于豚鼠血清。
豚鼠在激素和免疫反应方面与人类相似, 特别是豚鼠的免疫系统基因与人类基因的相似性高于小鼠,致敏后的豚鼠再次接触抗原会引起支气管平滑肌收缩甚至死亡的急性反应,比较适合用于研究速发型过敏性呼吸道疾病。注射马血清很容易复制过敏性休克动物模型。豚鼠迟发性超敏反应与人类相似,如皮内结核菌素试验,因而较适合于进行这方面的研究。
豚鼠免疫,分子量小于20KD,首次注射抗原大于50μg/只;分子量大于20KD,首次注射抗原大于30μg/只。可使用多种免疫原见表1。
表1 常用免疫原
分类 | 抗原种类 | 优势 |
小分子 | 小分子与BSA、OVA等载体蛋白偶联 | 化学偶联制备方案多样 |
多肽 | 预测评估B细胞抗原表位,多肽合成及KLH偶联 | 免疫表位明确,生产周期短,制备便捷 |
磷酸化、乙酰化、甲基化等多肽合成及偶联 | 位点特异性准确,设计合成方便 | |
重组蛋白 | 大肠杆菌表达、昆虫杆状系统、哺乳动物细胞、天然提取 | 表达体系成熟,应用范围广泛,可以大规模生产 |
天然蛋白 | 裂解物、纯化蛋白 | 保留天然抗原结构表位,抗原丰度高,活性好 |
细胞 | 转染细胞系、天然细胞系 | 保留抗原天然结构、正确的天然修饰与折叠 |
核酸 | 目标基因载体构建与质粒大提 | 价格便宜,制备方便,目标蛋白体内表达,折叠正确,糖基化与转录后修饰完备 |
免疫豚鼠获得多克隆抗体
(1)B细胞克隆和生物物理多样性,可以结合靶点蛋白的多个抗原决定簇,多抗通常比单抗配对有更高的灵敏度及线性范围。
(2)多抗在靶蛋白、细胞或生物体的测定中更加敏感,即使部分抗原表位被交联遮挡,例如在染色质免疫沉淀 (ChIP)、免疫组织化学 (IHC) 中、具有显著优势。
(3)当环境因素可能导致其他形式的抗体失活、不稳定或沉淀时,多抗的生物物理多样性使其具有更高的稳定性,多抗更能抵抗温度和 pH 值的变化。
(4)多抗亲和力更容易提高、在抗原“逃逸突变”也同样具有作用。
(5)多抗在免疫比浊测定是首选,每个抗体可以与抗原上的不同表位结合。
(6)在低丰度蛋白和高丰度蛋白以及低免疫原性和高免疫原性蛋白检测方法开发中更容易成功
(7)物种近缘关系差异,特别是哺乳动物靶标或者物种之间具有高度同源性的蛋白质产生更强的免疫反应。
(8)多抗的产生方案可以灵活设计:抗原种类、注射剂量、注射途径、注射部位、抗原注射频率、佐剂类型及用量等优化后会产生更高亲和力的抗体,并增加多抗产量。