实验介绍
双荧光素酶报告基因系统是一种常用于microRNA靶基因研究、转录启动子相互作用、启动子活性及信号通路等的技术。该系统含有两种萤光素酶，常用萤火虫萤光素酶（Firefly Luciferase）和海肾萤光素酶（Renilla Luciferase），萤火虫荧光素酶作为报告基因，海肾荧光素酶作为内参基因。实验原理是利用荧光素酶与底物反应过程中释放的荧光，将感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒，然后转染细胞，裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过计算出两种荧光值的比值，进而比较各组间萤光素酶活性差异，从而判断基因表达情况。
图1 双荧光素酶报告基因作用图
服务流程
实验流程
1. 报告基因质粒的构建
2. 转染细胞和细胞培养
3. 细胞裂解
4. 测定荧光值
5. 数据处理
服务内容
服务项目 | 服务内容 | 客户提供 | 实验周期 | 结果交付 | 价格（元） | 其他 |
miRNA和靶基因验证 | 报告基因载体（野生和突变型） 双荧光素酶检测结果 实验报告 | 1. 实验信息（包含物种，miRNA序列，3’UTR序列或靶点序列等）。 2. 若使用特定细胞，客户需提供细胞。 | 5-6周 | 1.载体质粒及测序结果 2.检测数据及实验报告 | 询价 | 1.若使用特定细胞，实验周期需调整）； 2.若客户已构建相关质粒，需提供测序信息。 |
细胞培养及转染 | ||||||
荧光素酶检测 | ||||||
转录因子和启动子结合验证 | 启动子和转录因子结合位点预测 | 1. 实验信息（包含物种，靶基因和启动子等）。 2. 若使用特定细胞，客户需提供细胞。 | 5-6周
| 1.载体质粒及测序结果 2.检测数据及实验报告 | 询价 | 1.若使用特定细胞，实验周期需调整）； 2.若客户已构建相关质粒，需提供测序信息。 |
启动子荧光素酶载体的构建（包含野生型和突变型） | ||||||
转录因子表达载体的构建 | ||||||
细胞培养及转染 | ||||||
荧光素酶检测 |
结果示例图
miRNA和靶基因验证：
Li M, et al. 2010, doi:10.1038/ncb2024.
结果解析：为了确定miR-9是否直接靶向CDH1，通过双荧光酶报告基因检测发现miR-9能够降低与CDH1mRNA野生型3'UTR融合的荧光素酶报告基因的活性，但对突变型3'UTR则无此作。
转录因子和启动子结合验证：
Sun ZH, et al. 2023, doi: 10.1016/j.biopha.2023.114480.
结果解析：为验证NFATC1与 NOX4的结合机制，首先通过数据库预测到NFATC1在人NOX4启动子区域可能结合的3个位点。利用pGL3-basic构建了这3个可能结合位点（TFBSs）及相应位点突变的报告载体。结果显示NFATC1可以直接结合NOX4启动子，参与NOX4转录，并确定了NFATC1可以结合到NOX4启动子的TFBS2和TFBS3上，调控NOX4的转录。
参考文献：
1. Ma L, Young J, Prabhala H, Pan E, Mestdagh P, Muth D, Teruya-Feldstein J, Reinhardt F, Onder TT, Valastyan S, Westermann F, Speleman F, Vandesompele J, Weinberg RA. miR-9, a MYC/MYCN-activated microRNA, regulates E-cadherin and cancer metastasis. Nat Cell Biol. 2010 Mar;12(3):247-56. doi: 10.1038/ncb2024. Epub 2010 Feb 21. PMID: 20173740; PMCID: PMC2845545.
2. Sun ZH, Liu F, Kong LL, Ji PM, Huang L, Zhou HM, Sun R, Luo J, Li WZ. Interruption of TRPC6-NFATC1 signaling inhibits NADPH oxidase 4 and VSMCs phenotypic switch in intracranial aneurysm. Biomed Pharmacother. 2023 May;161:114480. doi: 10.1016/j.biopha.2023.114480. Epub 2023 Mar 10. PMID: 37002575.
