双分子荧光互补（BiFC）技术是指两种具有相互作用亲和力的蛋白质相互结合形成一个完整的荧光蛋白，从而表征蛋白质-蛋白质相互作用的发生和空间位置。
BiFC是由Hu等首次报道的一种新技术，能够直接快速地确定活细胞内目标蛋白的定位及其相互作用。文献报道，GFP两层片层之间的环状结构上存在许多特异性的异位斑点，这些斑点可以将外来蛋白插入而不影响GFP的荧光活性。BiFC技术正是利用了荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分成两个不发荧光的片段，然后分别与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因相互作用而相互靠近，则荧光蛋白的两个分子片段会在空间上相互靠近，形成活性荧光基因并发出荧光。在荧光显微镜下，我们可以在最接近活细胞生理状态下，直接观察两个目标蛋白是否相互作用，并观察形成的蛋白质复合物的时间、位置、强度、稳定性以及细胞信号分子对相互作用的影响。这些信息对蛋白质-蛋白质相互作用的研究具有重要意义。
目前已开发出许多检测生物分子相互作用的方法，但大多数方法依赖于精密的仪器和复杂的数据处理。BiFC 技术可以简单直接地观察活细胞中的相互作用事件。该方法已成功应用于多种不同类型的细胞和生物体，并且不需要相互作用伙伴的结构信息以及外源荧光团或染料来染色细胞。
图 1. BiFC 检测原理示意图（Kerppola，TK 2006）
亮点
- 直接检查活细胞中的蛋白质相互作用
- 能够检测瞬态、间接和弱相互作用
- 高灵敏度和准确性
BiFC 系统：
- 分裂荧光蛋白（YFP）
该体系适用于蛋白质-蛋白质相互作用强的研究，YFP的荧光强度控制在较低水平，不受背景等因素的干扰。
- 分裂荧光蛋白（YFP）增强
该系统适用于研究膜蛋白相互作用等作用较弱的蛋白质-蛋白质相互作用，手动编辑YFPn和YFPc，增强YFP荧光，方便观察弱相互作用信号。
- 分裂荧光素酶（LUC）系统
该系统可用于对生物体进行观察和拍照，尤其适用于定量分析和比较相互作用强度。它适用于研究受第三方物质影响的蛋白质相互作用。例如，蛋白质相互作用的强度可以通过激素和小分子化合物来调控，而相互作用强度的变化可以通过观察外源激素化合物来确定。
实验工作流程：
- 构建含有目的蛋白的质粒时，客户需要确认目的蛋白是连接在荧光蛋白的N端还是C端。
- 将重组质粒转化至农杆菌中。
- 烟草叶中注射了农杆菌。
- 采用共聚焦显微镜观察并拍照。采用流式细胞术进行高通量筛选和表征。
- 生物信息学分析。
- 通过蛋白质片段互补试验、细胞免疫荧光或免疫共沉淀进一步验证诱饵相互作用蛋白。（可选）
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