细菌是最广泛使用的蛋白质表达系统，由于其生长速度快、产量高、培养条件简单且易于规模化生产，已实现重组蛋白的快速生产。细菌表达系统还具有生产成本低、可扩展性强等特点，使其成为重组蛋白生产的理想选择。
最广泛使用的细菌宿主是大肠杆菌。它是最成熟的工具，并且在适用时几乎总是首选。大肠杆菌已实现各种重组蛋白（如细胞因子、酶、免疫原和抗体片段）的高效表达和生产。另一种细菌枯草芽孢杆菌是越来越受欢迎的蛋白质表达宿主，并且是 FDA 指定的公认安全 (GRAS) 生物。它是一种革兰氏阳性菌，这使得该系统没有内毒素问题。它的密码子偏向性也比大肠杆菌小得多。此外，它将蛋白质直接分泌到培养基中，从而大大简化了后续的蛋白质纯化步骤。所有上述特点使其成为在实验室和工业水平上生产可溶性且正确折叠的重组蛋白的有吸引力的系统。
在所有表达宿主中，大肠杆菌由于操作简便、成本低廉，通常是适用时的首选。
我们的服务
迈博睿生物为您提供细菌生产的终极解决方案。我们的服务可根据您的特殊需求（密码子优化、标签选择、纯度、内毒素去除、蛋白质重折叠等）量身定制，以最佳匹配您的下游应用。我们的专业知识保证了蛋白质的高质量、快速的交付周期和市场最优的价格。
我们的服务流程
基因合成和质粒制备：密码子优化、亚克隆、DNA质量控制。
蛋白表达评估与优化：利用SDS-PAGE和Western blot确认表达水平，优化蛋白表达条件。
扩大生产和蛋白质纯化：使用优化条件扩大蛋白质表达，标准：蛋白质纯度>90%，内毒素<1.0 EU/μg。
我们的特色服务
蛋白质标记：各种蛋白质标记技术，包括同位素标记、生物素化和 HRP 结合物。
内毒素去除：准确的内毒素检测和去除服务，检测水平低于1.0 EU/μg。
包涵体复性：包涵体复性条件筛选、包涵体处理、纯化及分析方法优化。
亮点
- 快速、可扩展的生产
- 可定制的一站式服务
- 提供质量控制数据和总结报告
- 省时又省钱
大肠杆菌中重组蛋白表达方案
1. 小规模表达式评估和表达式优化
我们的服务可帮助您评估目标蛋白在您所选表达系统中的表达情况；并确定能够最稳定地表达目标蛋白的构建体和条件。我们可以根据您的具体需求，与您合作设计表达试验。在所选大肠杆菌菌株中验证可溶性蛋白的表达通常需要 1-2 周。
2. 标准程序：
a. 分子克隆：
将目的基因插入到选定的表达载体中。通常，目标蛋白会与蛋白标签融合，以便于表达和纯化（例如，6*组氨酸）。蛋白标签可以插入目标基因的N端或C端，以实现融合蛋白表达[3]。蛋白标签的选择和位置通常取决于目标蛋白的性质、表达条件和客户的应用。可以在目标蛋白和蛋白标签之间插入一个蛋白酶切割位点，以便在纯化后去除蛋白标签。此外，表达载体还包含抗生素抗性标记，用于克隆筛选[4]。
b. 将表达载体转化至化学感受态细胞中。
感受态细胞是指能够轻易摄取外源DNA（此处指含有待表达目标蛋白的DNA）的细胞。以下是适用于大多数表达载体和细胞系的标准实验方案。
| i. | 将目标载体加入解冻的感受态细胞中。 |
| ii. | 将细胞在冰上孵育，然后用热休克和冰休克处理。 |
| iii. | 将液体培养基加入到处理过的感受态细胞中进行恢复。 |
| iv. | 将转化细胞接种到含有相应抗生素的琼脂平板上，进行克隆选择。 |
c. 表达测试。
为了确定目标蛋白生长表达的最佳条件，我们进行了温度、诱导时间和表达时间等复杂的表达试验。
| i. | 将构建的表达载体转化选定的大肠杆菌菌株感受态细胞进行表达。 |
| ii. | 通过抗生素筛选选择合适的菌落。 |
| iii. | 将含有重组质粒的正确菌落接种于LB中培养，直至OD600达到一定值。 |
| iv. | 分开培养，在选定的不同温度下平衡，并通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 来诱导表达。 |
| v. | 继续细胞生长并在诱导后的不同时间点采集样本。 |
| vi. | 剩余的培养物被允许继续生长并最终收获。 |
| vii. | 然后通过超声处理将所有样品裂解，然后离心以分离上清液和沉淀物，以进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。 |
| viii. | 在 DNase 消化之前，将重新悬浮的细胞进行一次冻融循环。 |
| ix. | 离心裂解细胞以去除细胞碎片，并通过滤膜过滤上清液。 |
请注意，IPTG诱导前的OD600值、IPTG浓度、表达温度和收获时间点等参数可以根据重组蛋白的表达状态进行调整。
d. 蛋白质纯化
细菌裂解物的制备对于后续的蛋白质纯化至关重要。合适的细胞裂解条件可以最大限度地提高重组蛋白的提取率，最大限度地减少不必要的蛋白水解以及基因组DNA和蛋白质氧化对样品的污染[1]。
| i. | 细胞裂解。在超声机械裂解或冻融裂解过程中，将溶菌酶添加到裂解缓冲液中。裂解缓冲液的pH值和盐浓度需要根据目标蛋白的物理化学性质（溶解度、等电点等）进行优化，以增强蛋白的溶解性和稳定性。蛋白酶抑制剂和还原剂，例如三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP），可用于保护目标蛋白免受复杂的细胞裂解液混合物的影响。 |
| ii. | 层析纯化蛋白质。重组蛋白的一大优势在于，通过添加蛋白质纯化标签，纯化过程得以大大简化。因此，可以利用蛋白质标签上特定金属或抗体的特异性结合，进行亲和层析，从而实现与目标蛋白的强效特异性结合。
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迈博睿生物在蛋白质表达领域积累了丰富的经验。我们专业的技术团队可以为客户提供高质量的细菌表达系统及一系列相关的特色服务。我们极具竞争力的价格和丰富的专业知识赢得了合作伙伴的信任。
