背景

重组杆状病毒广泛用于在培养的昆虫细胞中表达异源基因。杆状病毒是DNA病毒家族，是已知对昆虫种群影响最显著的病毒之一。病毒复制过程通常分为三个阶段，其中野生型杆状病毒的生命周期分为溶解期和闭塞期。这三个阶段的特点如下：

因此，随着病毒感染的进展，可以观察到感染细胞的多种形态变化。感染周期的时间点和细胞形态变化因所用的昆虫细胞系和杆状病毒株而异。然而，感染细胞会表现出一些共同的行为[2]。

BEVS 技术的优势

重组杆状病毒广泛用于在培养的昆虫细胞中表达异源基因。杆状病毒表达载体系统 (BEVS) 在大规模应用中尤其具有优势。它利用高效的位点特异性转座系统来生成重组杆状病毒，以实现重组蛋白的高水平表达。当用作表达载体时，插入的异源基因将置于强启动子的转录调控之下，从而确保目标蛋白的表达。表达的重组蛋白随后被加工、修饰并定位到合适的细胞位置。杆状病毒表达系统中包含一些关键元件，这些元件有助于快速高效地生成重组杆状病毒。

实验概要

下面的流程图说明了使用杆状病毒表达系统表达目标蛋白所需的一般步骤。

杆状病毒制备方案

您可以在下面找到我们在实验室中通常使用杆状病毒系统进行的操作：

1. 昆虫细胞的培养。

昆虫细胞对环境因素非常敏感。因此，在培养昆虫细胞之前，需要优化一些化学、营养和物理培养因素（温度、培养基渗透压、通气量、pH值和剪切力）。

2.克隆到杆状病毒供体质粒。

将目标基因插入杆状病毒供体质粒的读框内，该质粒将目标蛋白与6*组氨酸标签和蛋白酶切位点融合。克隆的基因可以插入标签的下游/上游进行融合蛋白表达，具体取决于目标蛋白的表达条件和稳定性。蛋白标签和目标蛋白之间的蛋白酶切位点可在纯化后从目标蛋白中去除标签。此外，该载体还包含抗生素抗性基因，可用于进一步的克隆筛选。我们还可以根据您的具体需求设计质粒。

3.转换与分析。

一旦我们将目标基因克隆到杆状病毒供体载体中，就会将连接产物化学转化为大肠杆菌菌株，以进行重组质粒筛选。

4. 杆粒的生成。

本步骤中，将构建的目的基因-杆状病毒供体载体转化至特定的大肠杆菌菌株，并转化至杆粒，通过蓝白斑筛选，筛选出含有重组杆粒的菌落。

请注意，重组杆粒 DNA 的扩增结果可能会因您选择的 PCR 正向和反向引物组合不同而存在很大差异。在分析扩增的 DNA 条带之前，请先计算 PCR 产物的预期大小。

5.生产第一代重组杆状病毒。

一旦我们确认重组杆粒内目标基因的存在和正确方向，下一步将是转染昆虫细胞以产生第一批重组杆状病毒。

请注意，通过优化转染条件（例如改变 DNA/转染试剂浓度/比例以及调整细胞密度）可以达到最高的转染效率。

6. 分离杆状病毒原液第1代（P1）。

扩增的病毒应在转染后数天释放到培养基中，具体取决于转染效率。一旦肉眼检查发现细胞出现感染迹象，应按以下步骤从细胞培养基中收获病毒：

请注意，如需长期保存，请将病毒液分装于-80°C保存，以便将来再次扩增。避免反复冻融。

7. 扩增 P1 杆状病毒库存（可选）。

由于P1病毒库为低滴度病毒库，我们可以扩增重组杆状病毒，制备第二代（P2）病毒库，用于后续的表达实验。

请注意，每个杆状病毒载体的最佳收获时间可能有所不同。我们也可以按照上述步骤，将扩增程序扩大到您所需的体积。

8. 初步表达实验。

请参阅下面提供的一般指南，了解如何使用重组杆状病毒感染细胞以表达目标蛋白。