酵母蛋白表达-酵母蛋白表达-西安迈博睿（Mabioway）生物科技有限公司

酵母蛋白表达

简要描述：

酵母是最简单的真核表达系统。它能够维持真核蛋白质的翻译后修饰和正确折叠，同时易于培养，并能以相对较低的成本实现规模化生产。该系统也用于膜蛋白的表达和生产。目前，

酵母是最简单的真核表达系统。它能够维持真核蛋白质的翻译后修饰和正确折叠，同时易于培养，并能以相对较低的成本实现规模化生产。该系统也用于膜蛋白的表达和生产。目前，许多重组跨膜蛋白（包括人水通道蛋白2、鸡卵巢黄斑萎缩蛋白-1和小鼠P-糖蛋白）的晶体结构已通过该高效系统获得。

毕赤酵母 (Pichia pastoris)是重组蛋白表达最常用的酵母菌种。其培养简单且成本低廉。它生长迅速，可达到高细胞密度，并支持真核蛋白的高产量和大规模生产。它也是糖基化或二硫键蛋白的推荐系统。迈博睿生物设计带有强启动子的表达载体，支持目标蛋白的分泌或胞内生产。酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 是目前最容易理解的真核菌种。除了与毕赤酵母类似的优势外，它还被美国食品药品监督管理局 (FDA) 认定为 GRAS（一般认为安全）生物。

毕赤酵母是一种甲基营养酵母，可以用作异源表达系统。它是一种单细胞微生物，像大肠杆菌一样易于操作和培养。同时，作为真核生物，它具备高等真核细胞进行翻译后修饰的能力。因此，在细菌表达系统中以无活性包涵体形式表达的蛋白质，在毕赤酵母中可以生产为具有生物活性的分子，并进行正确的蛋白水解加工、折叠、二硫键形成和糖基化。此外，与从高等真核生物（如昆虫细胞和哺乳动物组织培养细胞系统）开发的表达系统相比，毕赤酵母系统也被认为更容易、更快速和更经济。毕赤酵母系统中的蛋白质表达水平通常也高得多。作为酵母，它与酵母菌一样具有易于遗传操作的优势；此外，它还具有比酵母高10到100倍的异源蛋白表达水平的优势。以上特性使得毕赤酵母成为一个非常有用的蛋白表达系统。值得一提的是，一些最初为酵母菌开发的技术，包括互补转化、基因破坏和基因置换，也适用于毕赤酵母。

毕赤酵母

毕赤酵母是一种甲基营养酵母，因此能够代谢甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是分子氧将甲醇氧化成甲醛。该反应除了生成甲醛外，还生成过氧化氢。为了避免过氧化氢的毒性，甲醇代谢通常在过氧化物酶体（一种特殊的细胞器）中进行。催化甲醇氧化的酶——醇氧化酶对氧的亲和力较差，因此毕赤酵母必须产生大量的酶作为补偿。同时，调控酶产生的启动子因此被用来驱动毕赤酵母中的异源蛋白表达。

毕赤酵母中有两个编码醇氧化酶的基因：AOX1 和 AOX2。通常，该酶的大部分活性依赖于AOX1基因。其表达主要受甲醇控制。使用质粒载体版本的AOX1启动子来诱导插入目的基因表达，从而获得所需的异源蛋白。尽管AOX2与AOX1的同源性约为 97% ，但它在甲醇中的生长速度远慢于AOX1。

更具体地说，AOX1基因的表达在转录水平上受到调控。AOX1基因的调控是一个两步过程，包括抑制机制和诱导机制。由于在葡萄糖上生长即使在甲醇存在的情况下也会抑制转录过程，因此建议在甘油上生长，以获得最佳的甲醇诱导效果。

至于外源蛋白在毕赤酵母中的表达模式，根据所选的表达载体，可以是胞内表达，也可以是分泌表达。分泌需要蛋白质上存在信号肽，才能通过分泌途径进行。分泌表达外源蛋白的一大优势在于毕赤酵母本身分泌的天然蛋白水平非常低。因此，分泌的外源蛋白构成了毕赤酵母生长培养基中总蛋白的大部分，从而简化了后续的蛋白质纯化步骤。

毕赤酵母中的翻译后修饰通常包括信号序列的去除、折叠、二硫键的形成以及O-/N-连接糖基化。在哺乳动物中，O-连接寡糖由N-乙酰半乳糖胺、半乳糖和唾液酸等糖组成[2]。而在低等真核生物（例如毕赤酵母）中，添加的O-连接寡糖仅指甘露糖残基。

毕赤酵母已成为一个非常成功的外源基因表达系统，其迅速传播和广泛应用的重要因素概括为以下几点[2]。

a. 一种源自毕赤酵母（P.pastoris ）醇氧化酶I（ AOX1）基因的启动子，适用于外源基因的精确表达。b .毕赤酵母的分子遗传操作技术与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）类似，后者是现代生物学中最为成熟的实验系统之一。c .毕赤酵母偏好呼吸生长，这是一个关键的生理特性，使其能够比发酵酵母在高细胞密度下培养。

酵母表达

毕赤酵母是一种甲基营养酵母。它们生长速度快，能够在简单、廉价的培养基中生长。

酵母表达

酿酒酵母用于酿造葡萄酒、面包和啤酒。它们的特点是无法利用硝酸盐，但能够发酵各种碳水化合物。

迈博睿生物为您提供酵母生产的终极解决方案。我们的服务可根据您的特殊需求（密码子优化、标签选择、纯度、内毒素去除等）量身定制。我们的专业知识保证了蛋白质的高质量、快速的交付周期以及市场最优的价格！

服务详情

密码子优化、基因合成和亚克隆
毕赤酵母或酿酒酵母的转化
顶级表达克隆筛选和菌株创建
表达优化
净化测试
蛋白表达扩增与纯化
大规模蛋白纯化（培养体积可达500L）
流程开发

特征

二硫键蛋白表达
糖基化蛋白表达
产量高：产量可达5-10g/L
稳定的生产工艺
一站式服务：从基因合成到蛋白表达，以及下游应用开发

实验概要

下面的流程图说明了使用毕赤酵母表达系统生产重组蛋白所需的整个实验过程。

实验概要

使用毕赤酵母表达系统进行重组蛋白表达的方案

以下协议可供您参考，以了解有关我们实验室所使用的技术和使用P.pastoris生产目标蛋白质的工作流程的更多细节。

1. 为你的目标基因选择合适的表达载体。

如果您的蛋白质位于胞浆且未糖基化，您可以选择在胞内表达。如果您的蛋白质通常分泌、糖基化或定位到胞内细胞器，您也可以将目标蛋白质分泌到培养基中。

2. 转化大肠杆菌。

a	将目标基因插入到表达载体的框架中。
b	将连接混合物通过电穿孔或化学方法转化大肠杆菌。
b	将 LB 培养基添加到细胞中，以便在热休克或电穿孔后恢复。
d	在含有 Zeocin 的 LB 培养基上进行培养。
e	孵育过夜。

3. 分析转化子。

a	选择 Zeocin 抗性的菌落并接种到含有 Zeocin 的 LB 培养基中。
b	培养过夜并分离质粒 DNA。
c	对基因构建体进行测序，以确认基因在载体内的正确插入。

4. 转型准备

在毕赤酵母中进行转化和筛选之前，质粒应进行线性化。在5' AOX1区域内线性化的载体将通过基因插入整合到宿主的5' AOX1区域。

a	用选定的限制性酶消化质粒 DNA。
b	通过琼脂糖凝胶电泳检查消化混合物是否完全线性化。
c	一旦确认载体完全线性化，立即采用热处理失活或加入EDTA停止反应。
d	使用苯酚/氯仿提取 DNA，使用乙醇沉淀 DNA。
e	将溶液离心并用乙醇清洗沉淀 DNA。
f	风干后将 DNA 重新悬浮于无菌水中，以便立即使用或储存在 -20°C 下。

5.毕赤酵母的电穿孔。

强烈推荐电穿孔方法，因为它在毕赤酵母中具有最高的转化频率。

a	将选定的P.pastoris菌株在酵母培养基中培养过夜。
b	在过夜培养物中加入新鲜培养基。再次过夜培养。
c	离心细胞并用冰冷的无菌水重悬。重复两次。
d	离心细胞，然后用冰冷的山梨醇重悬。重复两次。使用前将细胞置于冰上。
e	将细胞与线性化的 DNA 混合。
f	将混合物转移至冰冷的电穿孔杯中。冰上孵育。
g	将冰冷的山梨醇添加到细胞中，然后转移比色皿内容物并在 30°C 下孵育。
h	将细胞铺展在平板上，以进行 Zeocin 筛选。
i	孵育培养皿直至形成菌落。
j	挑选 10-20 个菌落进行进一步选择。

6. 分析毕赤酵母转化体

a	将选定的毕赤酵母单菌落接种于酵母培养基中，过夜培养。
b	稀释隔夜培养的细胞并培养约 4-6 小时。
c	离心细胞并保留沉淀物。
d	重新悬浮细胞沉淀并得到感受态细胞。
e	细胞可以保存在室温下并立即用于转化试验或冷冻储存。

7. 转化试验

以下步骤详细介绍了如何转化新鲜制备或冷冻的Pichia感受态细胞。请注意，转化效率可能因所用Pichia菌株和表达载体的不同而有所差异。

a	将线性化的重组载体 DNA 添加到感受态细胞中。
b	将含有 PEG 的溶液添加到 DNA/细胞混合物中。
c	转化反应在30°C下孵育1h。混匀反应溶液以提高转化效率。
d	用热休克处理并将细胞分装到微量离心管中进行孵育。
e	离心细胞并保留沉淀物。
f	重新悬浮并合并细胞。
g	将细胞接种于培养皿中进行筛选。孵育直至出现菌落。

8. 确定 Mut (甲醇利用缓慢) 表型。

通过SDS-PAGE分析鉴定所选几个Mut表型的表达水平，筛选出高表达的Pichia重组克隆，为优化重组克隆的表达条件提供参考。

具有Mut表型的毕赤酵母菌株的表达条件的有效性可以通过如下方法进行测试。

a	包括用亲本载体转化的对照基因作为背景细胞内表达的对照。
b	将单个菌落接种于带挡板的摇瓶中，并在 28-30°C 下生长。
c	收获细胞并在室温下离心。
d	弃去上清液，重新悬浮细胞沉淀。用两层无菌纱布覆盖培养瓶，继续培养。
e	每24小时添加一次甲醇以维持诱导。
f	将 1 ml 表达培养物转移到新的微量离心管中，以分析一系列时间点（即诱导后 0-96 小时）的表达水平。
g	确定收获细胞的最佳时间。室温下离心细胞。
h	对于分泌型表达，将上清液转移至新管中并保存直至检测。对于胞内表达，弃去上清液，将细胞沉淀保存直至检测。
i	通过 SDS-PAGE 和蛋白质印迹分别分析上清液和细胞沉淀物的蛋白质表达。