蛋白与羧化金纳米颗粒共价结合

金纳米颗粒缀合物已广泛应用于生物研究和生物传感应用。例如，金纳米颗粒可以用作光学或电子显微镜、侧流免疫测定和免疫印迹方案（例如斑点印迹和蛋白质印迹）中的探针。 

制备金缀合物有两种方法，即被动吸附和通过连接体的共价偶联。尽管制备过程相对简单，但蛋白质对金纳米颗粒的被动吸附并不能提供涂层的永久附着，因为随着时间的推移，分子可能会从表面解吸。此外，在某些情况下，蛋白质在吸附到表面后会失去其特性，这可能是由于三级结构的变化或活性位点/抗原结合位点与金表面的结合使其难以接近而引起的。

尽管存在这些缺点，蛋白质被动吸附到金纳米颗粒上仍然很受欢迎，并且是生成蛋白质金缀合物的简单方法。通过被动吸附到标准球形金纳米粒子来制备金纳米粒子蛋白缀合物，可以使用我们方便的被动吸附金缀合优化套件进行优化。

与被动吸附相比，共价偶联将感兴趣的分子永久固定到功能化金纳米粒子（例如带有NHS、羧基或胺基团）上。与被动吸附方法相比，这种方法大大提高了蛋白质涂层的稳定性。共价偶联使用与待缀合分子上的特定化学基团反应的化学接头。因此，该方法比被动吸附方法更具特异性和可控性，并且可以针对特定应用优化共价缀合配体的数量。通过接头的共价偶联还具有最小化空间位阻和对缀合蛋白三级结构的影响的优点。总而言之，这对缀合蛋白的性质产生的有害影响较小。 

我们的羧基金纳米粒子、羧基金纳米海胆和羧基金纳米棒均依赖于 EDC/NHS 化学进行结合。EDC 和 NHS“激活”颗粒表面的羧基，形成中间体，随后与特定蛋白质或其他待缀合配体上的伯胺基团反应。EDC 缀合的效率通常较低，并且对 pH 值和共价键敏感耦合协议需要一定程度的优化才能实现所需的性能或稳定性。 

以下方案提供了将生物分子与我们的羧化金纳米颗粒偶联的一般指南，以标准 IgG 与我们的 20 nm 羧基金纳米颗粒的偶联为例。对于其他生物分子或纳米粒子类型的缀合，最佳缀合条件可能会有所不同。为了获得与颗粒表面的最大结合，用于结合的蛋白质的量比完全覆盖所需的理论量多大约1至10倍。

所需材料和设备

• 20nm羧基金纳米粒子 
• 甲基金纳米粒子（阴性对照）
• 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐 (EDC)（Sigma，目录号 E1769）
• N-羟基磺基琥珀酰亚胺 (Sulfo-NHS)（Sigma，目录号 56485）
• 阳性对照蛋白：辣根过氧化物酶 (HRP) 或来自人血清的 IgG（Sigma，目录号 I4506）
• 阻断剂：牛血清白蛋白 (BSA)（Sigma，目录号 A3059）
• 激活缓冲液：2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES) 缓冲液（10 mM，pH 5.5）
• 偶联缓冲液：1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)
• 洗涤缓冲液：1X 磷酸盐缓冲盐水 + 0.05% Tween 20 (PBST)
• 紫外可见分光光度计
• 待缀合的感兴趣的蛋白质

注意：待缀合的蛋白质必须是纯净的且不含污染蛋白质（例如 BSA）和其他含胺成分。任何其他含有伯胺的分子都可能与待缀合的蛋白质竞争，并可能导致缀合效率显着降低。该蛋白质还应该具有足够的可接近的伯胺基团用于缀合。赖氨酸残基是 EDC 缀合的主要靶位点。 

程序

1. 如果金纳米粒子的浓度低于OD 50，则通过离心浓缩它们。如果缓冲液中有颗粒，则通过离心在纯水中清洗它们。有关说明，请参阅“金纳米颗粒处理和储存”。
2. 在 MES 缓冲液中制备浓度分别为 30 和 36 mg/mL 的新鲜 EDC/NHS 混合溶液。请注意，EDC/NHS 在水溶液中会迅速水解，应在结合前新鲜制备。
3. 取 10 µL 20 nm 金纳米粒子（水中 OD 50）并与步骤 2 中制备的 10 µL EDC/NHS 混合溶液混合。
4. 室温孵育 30 分钟
5. 添加 1 mL PBST 并彻底涡旋 
6. 6,500 g 离心 30 分钟
7. 除去大部分上清液
8. 添加 10 µL 抗体（1 X PBS 中 1 mg/mL）*
9. 在水浴超声仪中超声 10 秒
10. 室温下搅拌孵育 2 至 4 小时
11. 添加 1 mL PBST 并彻底涡旋
12. 6,500 g 离心 30 分钟
13. 除去大部分上清液
14. 添加 50 µL PBS 和 1% BSA
15. 储存于 4 度即可使用

* 蛋白质的浓度可能会根据颗粒大小和要结合的蛋白质而变化。一般来说，蛋白质的量应比完全表面覆盖的量多 1 至 10 倍。应估计颗粒的总表面积和对接面积，以计算最佳的蛋白质含量。下表是将 IgG 与不同尺寸的羧基金颗粒结合的一般参考。其他蛋白质的计算类似，但需要计算您感兴趣的蛋白质的对接面积。

表 I.  EDC 缀合期间不同尺寸的羧基金纳米颗粒的 IgG 的建议量。IgG 分子的对接面积估计为 45 nm2。“NX全覆盖量”是指孵育量与颗粒表面全覆盖所需量之间的过量比。

问题

问：如何确保金纳米粒子缀合反应成功？答：可以使用免疫印迹（斑点印迹）或使用我们的即用型缀合 QC 侧流试纸试剂盒
来测试所得缀合物是否存在缀合抗体（或抗原）。 

问： 缀合的最佳缀合 pH 值是多少？
答：使用 EDC/NHS 活化羧化金纳米粒子通常在微酸性条件下进行，而缀合反应最佳在 pH 7-8 左右进行。 

问：可选的结合时间是多少？

答：在我们的标准方案中，我们在室温下结合蛋白质 2 至 4 小时。根据蛋白质的稳定性，应测试更短或更长的结合时间。EDC 的缀合效率通常较低，因此在许多方案中经常看到 2 小时的孵育时间。少于 2 小时的结合时间可能就足够了，具体取决于应用和蛋白质浓度。

问：一步共轭的优点和缺点是什么？
答：1步缀合的优点是程序简单。然而，一步缀合存在蛋白质之间交联的风险，而不是将它们缀合到颗粒上。这种风险取决于待缀合蛋白质的结构，这决定了蛋白质和颗粒之间可接近的羧基的比例。此外，过量的 EDC/NHS 会增加蛋白质交联的机会。建议进行蛋白质和 EDC/NHS 浓度的滴定实验，以找到具有最小蛋白质交联的最大缀合/性能的条件。

问：还有哪些因素会影响接合结果？
答：如果结合 pH 值和结合时间合适，但没有出现阳性结果，则需要确保 EDC/NHS 是在结合前新鲜配制的。EDC 应始终储存在 -20 度下。激活后有效去除多余的 EDC/NHS 对于防止它们交联蛋白质非常重要。